Documento sin título

REVISTA BIO CIENCIAS

ISSN: 2007-3380

http://revistabiociencias.uan.edu.mx


Control biológico in vitro por bacterias ácido lácticas aisladas de residuos de cervecería

In vitro biological control for lactic acid bacteria isolated from brewer´s grains

Gerbaldo G1,2*, Asurmendi P1, 2, Ruíz F1, 2, Pascual L1, Dalcero A1, 2, Barberis L.1

1Departamento de Microbiología e Inmunología. Universidad Nacional de
Río Cuarto. Ruta 36 Km. 601. (5800) Río Cuarto, Córdoba. Argentina.
2Miembro of Consejo Nacional de Investigaciones
Científicas y Tecnológicas (CONICET), Argentina.

*Corresponding Author:
Gerbaldo G., Departamento de Microbiología e Inmunología. Universidad Nacional de Río Cuarto. Ruta 36 Km. 601. (5800) Río Cuarto, Córdoba. Argentina. Tel. 54-0358-4676539. Correo Electrónico: ggerbaldo@exa.unrc.edu.ar


Información del Artículo


Revista Bio Ciencias 2(1): 58-67

Recibido: 14 de febrero de 2012
Aceptado: 09 de junio de 2012


Palabras Claves / Key Words


Bacterias ácido lácticas, Aspergillus sección Flavi, Listeria monocytogenes, Aflatoxina B1, biocontrol / Lactic acid bacteria, Aspergillus section Flavi, Listeria monocytogenes, Aflatoxin B1, biocontrol


Resumen


Los residuos de cervecería son suplementos de bajo costo y de fácil disponibilidad, sin embargo, el alto contenido de humedad los hace susceptibles a la degradación fúngica y al desarrollo de microorganismos patógenos. Las bacterias ácido lácticas (BAL) se encuentran formando parte de la microbiota de los granos de cebada, de manera tal, que podrían contribuir en la calidad y seguridad tanto de la malta como de los productos derivados. El objetivo de este estudio fue determinar la presencia BAL, especies fúngicas de Aspergillus sección Flavi, Listeria monocytogenes e incidencia de aflatoxina B1 (AFB1)  en residuos de cervecería, y evaluar in vitro el efecto antifúngico y anti-aflatoxicogénico de las BAL. El análisis de los residuos de cervecería mostró que, en general, los recuentos de BAL fueron elevados durante todos los períodos analizados, sin embargo, el recuento de Aspergillus sección Flavi, L. monocytogenes e incidencia natural de AFB1 fue variable. El hallazgo de L. monocytogenes es el primero informado en Argentina en este tipo de sustrato. Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis L47 y Lactobacillus cellobiosus L56 fueron las cepas más efectivas en inhibir el crecimiento y la producción de AFB1 de todas las cepas de Aspergillus sección Flavi ensayadas in vitro. Futuros estudios con estas cepas de BAL podrían realizarse para demostrar su efectividad in situ en estos sustratos alternativos destinados a la producción animal, así como también evaluar in vitro sus propiedades anti-listeria.


Abstract


Brewer´s grains are low cost and easy availability supplements, however, their high moisture level content makes them sentivie  fungi and pathogenic microorganisms development. Lactic acid bacteria (LAB)  found on the surface of malt barley may positively influence the quality and safety of malt and its derived products. The aim of this study was : i) to determine the presence of LAB, Aspergillus section Flavi strains and Listeria monocytogenes;  ii) to evaluate the natural incidence of aflatoxin B1 in brewer´s grains, and iii) to evaluate the antifungal and antiaflatoxicogenic effect of BAL in vitro. The analysis of brewer´s grains showed that BAL counts were high during all studied periods. However, the Aspergillus section Flavi counts, the presence of L. monocytogenes and the natural occurrence of Aflatoxin B1 (AFB1) were variable. The present study is the first report of the isolation of L. monocytogenes from brewer´s grains in Argentina. Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis L47 and Lactobacillus cellobiosus L56 were the strains that showed the highest in inhibiting the growth and AFB1 production of all Aspergillus section Flavi strains tested in vitro. Future studies with these LAB strains will be done to evaluate its effectiveness in brewer´s grains in situ as well as to study its antilisteria properties in vitro.


Introducción


Muchas producciones pecuarias de la región central de Argentina utilizan los co-productos de la industria cervecera como alimentos alternativos a las dietas tradicionales (Gerbaldo et al., 2011). Los residuos de cervecería son suplementos de bajo costo y de fácil disponibilidad, sin embargo, el alto contenido de humedad de los mismos dificulta el secado necesario para poder ser almacenados y posteriormente utilizados (Amaefule et al., 2006). La mayoría de los hongos filamentosos y microorganismos de origen bacteriano tales como, Salmonella spp., Escherichia spp., Listeria spp. son contaminantes habituales de las materias primas de alimentos destinados al consumo animal (Schanberger et al., 2004; Cotty et al., 2007; Oliveira et al., 2008; Carlson, 2011). Aspergillus spp., Penicillium spp. y Fusarium spp. Son los hongos toxicogénicos más frecuentemente aislados de granos de cereales y piensos almacenados (Rosa et al., 2009).

Las aflatoxinas (AFs) son metabolitos tóxicos secundarios producidos principalmente por Aspergillus flavus, A. parasiticus y A. nomius. Existen cuatro tipos de AFs: aflatoxina B1 (AFB1), aflatoxina B2 (AFB2), aflatoxina G1 (AFG1) y aflatoxina G2 (AFG2), siendo de particular interés la AFB1 debido a que es uno de los más potentes mutágenos y carcinógenos naturales conocidos (Iheshiulor et al., 2011; Reddy et al., 2011; Wang et al., 2011). Las micotoxinas son estables en los alimentos y resistentes a la degradación bajo procedimientos de cocción normales, por lo que es difícil eliminarlas una vez que se producen (Urrego et al., 2006). Las bacterias ácido lácticas (BAL) se encuentran formando parte de la microbiota de los granos de cebada, de manera tal, que podrían influir en la calidad y seguridad tanto de la malta como de los productos derivados (Lowe et al., 2004). El efecto preservante de las BAL está asociado principalmente a la producción de metabolitos secundarios tales como: ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno, bacteriocinas (Yang et al., 2005; Dalié et al., 2010). De esta manera el objetivo de este estudio fue determinar la presencia BAL, especies fúngicas de Aspergillus sección Flavi, Listeria monocytogenes e incidencia de AFB1 en residuos de cervecería, y evaluar in vitro el efecto antifúngico y antiaflatoxicogénico de las BAL.

 


Material y Métodos

Muestras

Un total de 20 muestras de residuos de cervecería de una fábrica de cerveza artesanal, ubicada en Villa General Belgrano (31º 59' S 64º 34' O), Córdoba, Argentina fueron tomadas durante el período Julio de 2010 - Junio de 2011. Todas las muestras fueron procesadas para determinar la presencia de BAL, Aspergillus sección Flavi y L. monocytogenes.

Aislamiento de BAL y A. flavus

Se realizaron diluciones seriadas de cada una de las muestras en agua peptonada estéril hasta obtener una dilución 10-6. Para el aislamiento de BAL, se tomó 1 mL de cada una de las diluciones y se colocaron por duplicado en placas de Petri estériles. Se depositó agar MRS (bioMérieux®, France) templado y se realizaron movimientos circulares a fin de homogenizar el contenido. Las placas se incubaron en microaerofilia a 37°C durante 48 h. Sólo las placas que contenían entre 30-300 unidades formadoras de colonias (UFC) se utilizaron para el recuento bacteriano. La identificación de las cepas de BAL se realizó mediante el sistema semiautomatizado API 50 CH (bioMérieux ®, Francia). Para el recuento fúngico, se tomaron 0.1 mL de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 y se inocularon por duplicado sobre los medios de cultivo agar diclorán cloranfenicol rosa de bengala (DRBC) y agar glicerol 18 % (DG18). Las placas se incubaron aeróbicamente a 25°C durante 7 días en oscuridad. Las placas que contenían entre 10 y 100 UFC fueron utilizadas para el recuento. Las especies fúngicas se identificaron según características morfológicas de acuerdo a la clave taxonómica de Klich (2002). Los resultados de ambos recuentos se expresaron como unidades formadoras de colonias por gramo (UFC g-1).

Aislamiento de Listeria spp.

El aislamiento de Listeria spp. fue desarrollado de acuerdo al método descripto en el Manual de Bacteriología Analítica de la Food and Drug Administration (FDA) (Hitchins, 1995), con modificaciones en los medios y en el suplemento selectivo empleado. Para el enriquecimiento no selectivo se adicionó 25 g de muestra a 225 mL de caldo tripticasa soya (CTS) y se incubó durante 24 h a 37ºC en microaerofilia. Posteriormente se colocó 1 mL del cultivo en 9 mL CTS suplementado con ceftazidima y tripaflavina para el enriquecimiento selectivo de L. monocytogenes, se reservó a 4ºC durante 24 h y posteriormente se incubó durante 24 h a 37ºC. El aislamiento se realizó en placas de medio PALCAM (Merck®) suplementado con ceftazidima y tripaflavina. A partir de colonias típicas se realizó coloración de Gram y se procedió a la identificación en género y especie según lo propuesto por el Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática (Holt et al., 1994). Las cepas identificadas como L. monocytogenes se conservaron en CTS con el agregado de glicerol al 30% a -20 ºC.

Incidencia natural de AFB1

Se tomaron 15 g de muestra, se adicionó 100 mL de acetonitrilo: agua (84:16 % v/v) y se homogenizó en shaker durante 30 min. Luego, se separaron las fases con papel de filtro Whatman Nº4 (Whatman, Inc., Clifton, New Jersey, USA) y 6 mL del filtrado se eluyó por una columna de limpieza Multisep AflaPat228® (Romer® Laboratorios, USA). Se recuperaron 4 mL del extracto, se secó por evaporación y se analizaron por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC). Para ello, el extracto seco se resuspendió en 500 µL de fase móvil, se tomó una alícuota de 200 µL y se le añadió 700 µL de una mezcla de trifluoracético-ácido acético-agua (20:10:70, v/v). La separación cromatográfica fue desarrollada sobre una columna de fase inversa (silica gel, 150 x 4.6 mm id., tamaño de la partícula 5-µ, VARIAN, Inc. Palo Alto, USA). Una mezcla de metanol:agua:acetonitrilo (17:66:17 v/v) se utilizó como fase móvil a una velocidad de flujo de 1.5 mL min-1. La fluorescencia de las AFs derivatizadas se detectaron a una longitud de onda de λ 360 nm y λ 440 nm. Curvas de calibración fueron construidas con diferentes concentraciones de AFB1. Aflatoxina B1 fue cuantificada por correlación del área de los picos cromatográficos de los extractos de las muestras y de las curvas estándares. El límite de detección de la técnica fue de 1 ng g-1 (Trucksess et al., 2002).

Efecto de las BAL sobre el crecimiento
fúngico

Las cepas de BAL a estudiar fueron cultivadas en caldo Rogosa (bioMérieux ®, Francia) e incubadas en microaerobiosis a 37°C durante 24 h. Luego del período de incubación, se realizó una suspensión en caldo MRS (bioMérieux ®, Francia) alcanzando una turbidez igual a la del tubo 0.5 de la escala de McFarland (1.5 x 108 UFC mL-1) y se inoculó 1 mL del cultivo de BAL en una placa de Petri estéril, se agregó caldo MRS (bioMérieux ®, Francia) adicionado con agar al 1.2 % templado y se homogeneizó el contenido. Por otra parte, a partir de un cultivo de Aspergillus sección Flavi de 7 días de crecimiento en agar extracto de malta (MEA), se tomó una asada, se colocó en un tubo eppendorf conteniendo agar semisólido y se mezcló con el asa a fin de homogeneizar el contenido. Con asa en punta, se tomó una asada de la suspensión anterior y se realizó una punción central en la placa que contenía la BAL en estudio. El ensayo, se incubó a 25-27°C durante 7 días. Se examinó diariamente el crecimiento fúngico a través de la medición del diámetro de la colonia fúngica. Para cada colonia fúngica, dos diámetros medidos en ángulo recto uno de otro, se promediaron para encontrar la media de los diámetros. Todos los diámetros se determinaron utilizando 3 replicas de cada interacción. La velocidad de crecimiento radial (mm h-1) se calculó por regresión lineal de la fase lineal de crecimiento y el tiempo en el cual la línea interceptó el eje x se utilizó para calcular la fase lag (h) en relación a la cepa fúngica y BAL. Paralelamente, se realizó un control positivo, en donde sólo se inoculó la cepa fúngica (Sitara et al., 2008). 

Efecto de las BAL sobre la producción
de AFB1

La extracción de AFs se realizó siguiendo la metodología propuesta por Geisen (1996) con modificaciones. De cada colonia de cada tratamiento, se tomaron tres asadas de caldo MRS (bioMérieux ®, Francia) adicionado con agar al 1.2 % (1 x 1 cm), se transfirió a un tubo eppendorf al cual se le adicionaron 600 µL de cloroformo. La mezcla fue centrifugada a 10,000 rpm durante 10 min. Los trozos de agar fueron removidos, el extracto clorofórmico fue transferido a otro eppendorf y se evaporó mediante el uso de nitrógeno. La determinación cuantitativa se realizó por cromatografía líquida de alta definición (HPLC) siguiendo la metodología propuesta por Trucksess et al., (2002).

Análisis estadístico

Los datos fueron evaluados mediante el análisis de la varianza (ANOVA) para determinar diferencias significativas entre los recuentos fúngicos y lácticos, parámetros de crecimiento y producción de AFB1. La prueba de Tukey fue utilizado para determinar diferencias estadísticas entre los tratamientos con un valor p<0.05. Los análisis se realizaron mediante el empleo del software InfoStat versión 2011. Grupo InfoStat, FCA, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina.

 


Resultados y Discusión

El recuento de BAL y de especies del género Aspergillus sección Flavi en los diferentes períodos analizados se observan en la Tabla 1. En cuanto a las BAL, la mayoría de los recuentos se encontraron en el orden de 108 UFC g-1. Los recuentos más altos se observaron durante los períodos comprendidos entre enero y febrero de 2011, con un rango entre 2.3 x 108 y 1.6 x 109 UFC g-1 y una media de 9.1 x 108 UFC g-1, mientras que durante el período de noviembre-diciembre de 2010 se obtuvieron los menores recuentos de BAL con un rango entre 5.35 x 107 y 2.5 x 108 UFC g-1 y una media de 1.5 x 108 UFC g-1. Por otro lado, los mayores recuentos de Aspergillus sección Flavi se observaron durante el período de noviembre-diciembre de 2010 con un rango de 1 x 103 - 4 x 104 UFC g-1 y una media de 2.35 x 104 UFC g-1. Sin embargo, durante el período de mayo-junio de 2011 no se aislaron especies fúngicas pertenecientes a este género.

Cuando se investigó la presencia de Listeria spp. En las diferentes muestras de residuos de cervecería, en sólo una de ellas se aisló L. monocytogenes correspondiendo al período noviembre-diciembre de 2010.

El análisis de la incidencia natural de AFB1 en el sustrato demostró que 5 muestras del total estudiado presentaron niveles detectables de la toxina. Las mismas fueron recolectadas entre los meses de septiembre 2010 y febrero 2011 (Tabla 1).

 

Tabla 1.
Determinación de BAL, Aspergillus sección Flavi, Listeria monocytogenes e incidencia natural de AFB1 en los residuos de cervecería.

Período de muestreo Rango de los recuentos Presencia Incidencia
BAL A. sección Flavi Listeria monocytogenes Niveles medios de AFB1 (ng g-1)
Jul-Ago 2010 3,43x108-4,7x108 1x103-1x104
-
ND*
Sep-Oct 2010 4,4x107-7,9x108 1x102-1x104
-
18,5
Nov-Dic 2010 5,35 x107-2,5x108 1x103-4x104
+
26,4
Ene-Feb 2011 2,3x108-1,6x109 1x104-2x104
-
17,2
Mar-Abr 2011 5,3x108-8,9x108 1x102-3x104
-
ND
May-Jun 2011 7,1x106-2,7x109 ND
-
ND

*ND: por debajo del límite de detección de la técnica 1 ng g-1; (-): ausencia de Listeria monocytogenes; (+): presencia de Listeria monocytogenes.

Estudios de crecimiento

Para este estudio, se seleccionaron colonias de BAL al azar de aquellas muestras en donde el recuento fúngico fue bajo, el de BAL fue alto y ausencia de Listeria spp. Las cepas fúngicas aisladas de los residuos de cervecería altamente productores de toxina (Gerbaldo et al., 2011) fueron depositadas en un centro de colección de la Universidad Nacional de Río Cuarto, Córdoba, Argentina (RC) (Aspergillus flavus RC2053, RC2054, RC2055, RC2056, A. parasiticus RC2062) y utilizadas para este ensayo. La identificación de las diferentes cepas de BAL fueron las siguientes: Pediococcus pentosaceus L6, Lactobacillus plantarum L12, Leuconostoc mesenteroides L18, L. coryniformis subsp. coryniformis L47, L. brevis L52 y L. cellobiosus L56. En la Tabla 2 muestra el efecto de las BAL sobre la fase de latencia de las diferentes cepas fúngicas. Se observó que el 50 % de las BAL aumentó significativamente (p<0.05) la fase de latencia de las cepas de Aspergillus sección Flavi, siendo L56 y L47 las cepas que mostraron el mayor incremento de dicho parámetro, alcanzando un máximo de 80 y 52 h, respectivamente. La Figura 1 muestra el efecto de BAL sobre la velocidad de crecimiento de A. sección Flavi. Los perfiles de velocidad de crecimiento mostraron que todas las BAL redujeron significativamente (p<0.05) el crecimiento de las cepas de A. sección Flavi estudiadas. Pediococcus pentosaceus L6, Leuconostoc mesenteroides L18 y Lactobacillus cellobiosus L56 suprimieron completamente el desarrollo micelial de Aspergillus Flavus RC2053 mientras que Lactobacillus brevis L52 inhibió completamente el crecimiento micelial de Aspergillus Flavus RC2054. La interacción de L. coryniformis subsp. coryniformis L47 con las cinco cepas de Aspergillus section Flavi ensayadas demostró una reducción significativa (p<0.05) en la tasa de crecimiento con respecto al control. La reducción de la tasa de crecimiento de Aspergillus flavus RC2053, RC2054, RC2055, RC2056 y A. parasiticus RC2062 fue de 95 %, 94 %, 92 %, 91 % y 97 %, respectivamente.

 

Tabla 2.
Efecto de las BAL sobre la fase de latencia de las cepas de Aspergillus sección Flavi.

Cepas de BAL Fase lag (h)
Aspergillus sección Flavi
RC2053 RC2054 RC2055 RC2056 RC2057
Control 25c 24bc 24d 21d 24cd
Pediococcus pentosaceus L6 - 18bc 20e 22cd 21d
Lactobacillus plantarum L12 40b 25bc 40a 35a 28bc
Leuconostoc mesenteroides L18 - 6c 5f 3e 30b
L. coryniformis subsp. coryniformis L47 47a 52ab 40a 25bc 50a
L. brevis L52 16d - 28c 28b 24cd
L. cellobiosus L56 - 80a 33b 36a 33bc

Valores medios de los datos por cuadruplicado. La media de los valores en las columnas con letras en común no son estadísticamente significativas de acuerdo al test de Tukey (p<0.05). RC2053, RC2054, RC2055, RC2056: A. flavus; RC2062: A. parasiticus. (–) Bajo esta condición las cepas no fueron capaces de alcanzar la fase exponencial.

 

Figura 1. Efecto de BAL sobre la velocidad de crecimiento de las cepas de Aspergillus sección Flavi
Valores medios basados en datos por cuadruplicado. RC2053; RC2054; RC2055; RC2056: A. flavus; RC2062: A. parasiticus.


Análisis de AFB1

El efecto de las diferentes BAL sobre la inhibición de la producción de AFB1 se muestra en la Figura 2. En general, cuando las cepas fúngicas se co-cultivaron con las diferentes BAL, la producción de AFB1 mostró un patrón similar al observado en la velocidad de crecimiento. La presencia de las cepas de BAL no estimularon la producción de AFB1 en ninguna de las cepas de Aspergillus sección Flavi ensayadas. Las cepas de Aspergillus section Flavi mostraron un reducción significativa (p<0.05) en la producción de AFB1 cuando fueron co-cultivadas con L. coryniformis subsp. corinyformis L47 y L. cellobiosus L56, con un decrecimiento en la producción de la toxina entre 75-100 % y 88-100 %, respectivamente. La producción de AFB1 por la cepa de A. flavus RC2056 fue significativamente (p<0.05) reducida por todas las cepas lácticas estudiadas comparadas con el control.

El análisis de los residuos de cervecería mostró que el número de BAL se mantuvo con recuentos elevados durante los meses analizados. No se encontró correlación entre los recuentos de BAL y la época del año, lo que indicaría que las variaciones de temperatura y humedad en Villa General Belgrano no influyen en el desarrollo de estos microorganismos. Los recuentos de BAL obtenidos en este trabajo coinciden con los resultados informados en un estudio previo realizado por este grupo de investigación (Gerbaldo et al., 2011) quienes obtuvieron recuentos similares al trabajar con el mismo sustrato. Sin embargo, no coincidimos con Wang et al., (2008) quienes informaron recuento de BAL del orden de 107 UFC g-1 cuando analizaron residuos de cervecería secos. Los altos recuentos de Aspergillus sección Flavi detectados en el período noviembre-diciembre 2010 sugieren que el desarrollo fúngico se vio influenciado por las condiciones climáticas debido a que en este período las temperaturas cálidas y el elevado porcentaje de humedad podrían haber favorecido el desarrollo de la microbiota, a diferencia del periodo mayo-junio 2011 en donde no se aislaron especies de Aspergillus sección Flavi, coincidiendo con la época invernal en donde las temperaturas oscilan entre -2 y 14°C. El hallazgo de L. monocytogenes es el primero informado en Argentina en este tipo de sustrato. El desarrollo de estos microorganismos patógenos podría afectar no sólo a los animales que consumen este alimento sino además a humanos que consumen carne de cerdo. Por otro lado, la presencia de hongos toxicogénicos constituye un riesgo potencial a la contaminación con AFs por lo que la inhibición de los hongos productores de toxina podría evitar la formación de AFB1 en los piensos. Sin embargo, en este estudio se pudo observar que en aquellas muestras en donde el recuento de cepas lácticas era elevado, el recuento de Aspergillus sección Flavi, presencia de L. monocytogenes y la incidencia de AFB1 era bajo o nulo, lo que nos permite pensar que las BAL ejercen un efecto biopreservante in situ.

Además este estudio demostró el efecto antifúngico de las BAL in vitro. Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis L47 y L. cellobiosus L56 fueron las cepas más efectivas en inhibir el crecimiento y la producción de AFB1 de todas las cepas de Aspergillus sección Flavi ensayadas in vitro. La inhibición de la velocidad de crecimiento de las cepas fúngicas por las BAL podría deberse a varios mecanismos; uno de ellos es la producción de metabolitos secundarios. Las BAL son capaces de producir diferentes tipos de moléculas bioactivas como: ácidos orgánicos, ácidos grasos, peróxido de hidrógeno y bacteriocinas (Ström, et al., 2002; Valerio, et al., 2009). La presencia de estas sustancias en el medio de cultivo podrían inhibir el desarrollo de las cepas de Aspergillus sección Flavi, como se observó en nuestros ensayos. El ácido láctico y el ácido acético son los principales productos de la fermentación de los carbohidratos producidos por las BAL. Estos ácidos difunden a través de la membrana de los microorganismos sensibles, reduciendo el pH citoplasmático y causando así la perdida de la viabilidad y destrucción celular (Gerez, et al., 2009; Dalié, et al., 2010).

Por otro lado, la fuerte actividad inhibitoria podría ser atribuida a la competición por los nutrientes entre las BAL y las cepas A. sección Flavi. En un cultivo en donde no se adicionan sustratos frescos durante el periodo de incubación, las BAL serían más competentes que los hongos, debido a que son microorganismos más simples y con un metabolismo más rápido. Resultados similares fueron obtenidos por Zara et al., (2003) y Kam et al., (2007) quienes ensayaron los efectos de las BAL sobre otras especies del género Aspergillus. Aryantha et al., (2007) informaron que Lactobacillus delbrueckii, L. fermentum y L. plantarum podrían controlar el crecimiento y la producción de AFs por cepas de A. flavus.

Cuando los aislados fúngicos crecieron en presencia de las BAL, la acumulación de AFB1  demostró la misma tendencia que la velocidad de crecimiento. Ninguna de las cepas de BAL estimuló la acumulación de AFB1  in vitro en ninguna de las cepas fúngicas ensayadas. Además, la producción de la toxina in vitro fue inhibida totalmente por la mayoría de las BAL estudiadas. Es probable que la baja concentración de AFB1 en presencia de las BAL pudiera deberse a la baja formación de biomasa micelial. La inhibición del crecimiento afectaría directamente la producción de AFB1 debido a la baja síntesis de las enzimas involucradas en la producción de la toxina. Por otro lado, la AFB1 es un metabolito secundario, el cual no es sintetizado durante el crecimiento primario del hongo, por ello, la inhibición del crecimiento podría reducir así su síntesis. Nuestros resultados coinciden con los de Zinedine et al., (2005) quienes demostraron la habilidad de las BAL en reducir la concentración de AFB1 en más de un 45 %. Otras investigaciones demostraron que una cepa de L. plantarum redujo significativamente la producción de AFB1 in vitro e in situ en granos de maíz contaminados con la toxina (Khanafari et al., 2007a y Khanafari et al., 2007b).

Este estudio presenta resultados promisorios con respecto a la inhibición del desarrollo de Aspergillus sección Flavi y la acumulación de AFB1 in situ como así también la reducción del crecimiento fúngico y la producción de AFB1 in vitro por las cepas lácticas. Además se demostró la presencia de L. monocytogenes, futuros estudios sobre la inhibición de listeria por BAL se están realizando por el grupo de investigación (datos no publicados). Las BAL aisladas de los residuos de cervecería son probablemente biocontroladoras naturales, las cuales son capaces de mejorar la seguridad microbiológica en estos alimentos alternativos destinados a la producción porcina en Argentina. Estas cepas bacterianas podrían ser una buena estrategia de control sobre el crecimiento fúngico y el de L. monocytogenes, como así también la producción de AFB1 en los piensos almacenados antes de ser destinados a la alimentación animal. Debido a que L. coryniformis subsp. coryniformis L47 y L. cellobiosus L56 fueron las mejores cepas de BAL en inhibir in vitro el crecimiento y la producción de AFB1, futuros estudios con estas cepas podrían realizarse para demostrar su efectividad in situ en estos sustratos alternativos destinados a la producción animal, como así también evaluar in vitro sus propiedades anti-listeria.


Literatura citada


Amaefule KU, Onwudike OC, Ibe SN, Abasiekong SF. Performance, cost benefit, carcass quality and organ characteristics of pigs fed high graded levels of brewers’ dried grain diets in the humid tropics. Pakistan Journal of Nutrition 2006; 5: 242-247.

Aryantha INP, Lunggani AT. Suppression on the aflatoxin-B production and the growth of Aspergillus flavus by Lactic Acid Bacteria (Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum and Lactobacillus plantarum). Biotechnology 2007; 6: 257-262.

Carlson, JC. Efficacy of European starling control to reduce Salmonella enterica contamination in a concentrated animal feeding operation in the Texas panhandle. BioMed Central (BMC) Veterinary Research 2011; 7: 9.
Cotty P, García R. Influences of climate on aflatoxin producing fungi and aflatoxin contamination. Journal of Food Microbiology 2007; 119: 109-115.

Dalié DKD, Deschamps DKD, Richard-Forget F. Lactic acid bacteria – Potential for control of mould growth and mycotoxins: A review. Food Control 2010; 21: 370-380.

Geisen R. Multiplex polymerase chain reaction for the detection of potential aflatoxin and sterigmatocystin producing fungi. Systematic and Applied Microbiology 1996; 19: 388-392.

Gerbaldo AG, Pereyra CM, Cavaglieri LR, Ruíz F, Pascual L, Dalcero AM, et al. Survillance of aflatoxin and microbiota related to brewer’s grain destined for swim feed in Argentina. Veterinary Medicine International 2011; 912480.

Gerez CL, Torino MI, Rollán G, Font de Valdez G. Prevention of bread mould spoilage by using lactic acid bacteria with antifungal properties. Food Control 2009; 20: 144–148.

Hitchins AD. Listeria monocytogenes. En: Food and drugs administrations. Bacteriological Analytical Manual. 8º ed. Arlington: Association of Official Analytical Communities (AOAC) international 1995; 10.01-11.08.

Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Novena edición. United States: Williams and Wilkins, Baltimore, MD, 1994. 527- 570.

Iheshiulor OOM, Esonu BO, Chuwuka OK, Omede AA, Okoli IC, Ogbuewu IP. Effects of Mycotoxinas in Animal Nutrition: A Review. Asian Journal of Animal Sciences 2011; 5 (1): 19-33.

Kam PV, Bianchini A, Bullerman LB. Inhibition of mold growth by sourdough bread cultures. RURALS: Review of undergraduate research in agricultural and life sciences 2007; 2(5): 1-12.

Khanafari A, Soud H, Miraboulfathi M, Karamei Osboo R. An in vitro investigation of Aflatoxin B1 biological control by Lactobacillus plantarum. Pakistan Journal of Biological Science 2007a; 10(15): 2553- 2556.

Khanafari A, Soudi H, Miraboulfathi M. Biocontrol of Aspergillus Flavus and aflatoxin B1 production in corn. Iranian Journal of Environmental Health, science and Engineering 2007b; 4(3): 163-168.

Klich MA. Identification of Common Aspergillus Species. Utrecht, The Netherlands. 2002.

Lowe DP, Arendt EK. The use and effects of lactic acid bacteria in malting and brewing with their relationships to antifungal activity, mycotoxins and gushing: A review. Journal of Institute of Brewing 2004; 110(3): 163-180.

Oliveira M, Guerra M, Bernardo F. Occurrence of Listeria monocytogenes in silages assessed by fluorescent in situ hybridization. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia 2008; 60(1): 267-269.

Reddy KRN, Raghavender CR, Salleh B, Reddy CS, Reddy BN. Potential of aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus strains on commercially important food grains. International Journal of Food Science and Technology 2011; 46: 161-165.
Rosa CAR, Keller KM, Keller LAM, González Pereyra ML, Pereyra CM, Dalcero AM, et al. Mycological survey and ochratoxin Anatural contamination of swine feedstuffs in Rio de Janeiro State, Brazil. Toxicon 2009; 53(2): 283-288.

Schamberger GP, Phillips RL, Jacobs JL, Diez-Gonzalez F. Reduction of Escherichia coli O157:H7 populations in cattle by addition of colicin E7-Producing E. coli to feed. Applied and Enviromental microbiology 2004; 70 (10): 6053-6060.

Sitara U, Niaz I, Naseem J, Sultana N. Antifungal effect of essential oils on in vitro growth of pathogenic fungi. Pakistan Journal of Botany 2008; 40 (1): 409-414.

Ström K, Sjögren J, Broberg A, Schnürer J. Lactobacillus plantarum MiLAB 393 produces the antifungal cyclic dipeptides cyclo(L-Phe-L-Pro) and cyclo(L-phe-trans-4-OH-L-Pro) and 3-Phenyllactic acid. Applied and Environmental Microbiology 2002; 68: 4322–4327.

Trucksess MW, Pohland AE. Methods and method evaluation for mycotoxins. Molecular Biotechnology 2002; 22: 287-292.

Urrego J, Díaz G. Aflatoxinas: Mecanismos de toxicidad en la etiología de cáncer hepático. Revista de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia 2006; 54(2): 108-116.

Valerio F, Favilla M, De Bellis P, Sisto A, de Candia S, Lavermicocca P. Antifungal activity of strains of lactic acid bacteria isolated from a semolina ecosystem against Penicillium roqueforti, Aspergillus niger and Endomyces fibuliger contaminating bakery products. Systematic and Applied Microbiology 2009; 32: 438–448.

Wang F, Nishino N. Ensiling of soybean curd residue and wet brewers grains with or without other feeds as a total mixed ration. Journal of Dairy Science 2008; 91: 2380–2387.

Wang J, Ogata M, Hirai H, Kawagishi H. Detoxiction of aflatoxin B1 by manganese peroxidase from the white-rot fungus Phanerochaete sordid YK-624. FEMS Microbiological Letters 2011; 314: 164-169.

Yang VW, Clausen CA. Determining the suitability of Lactobacilli antifungal metabolites for inhibiting mould growth. World Journal of Microbiology and Biotechnology 2005; 21: 977-981.

Zara ML, Belc N, Bahrim G, Vasile A. The study of antifungal action expressed by some bacterial selected strains. Food Technology 2003; 6: 80-84.

Zinedine A, Faid M, Benlemlih M. In vitro reduction of aflatoxin B1 by strains of lactic acid bacteria isolated from Moroccan sourdough bread. International Journal of Agriculture and Biology 2005; 7(1): 67-70.

 

 

Enlaces refback

  • No hay ningún enlace refback.


Revista Bio Ciencias, Año 10, vol. 6,  Enero 2019. Sistema de Publicación Continua editada por la Universidad Autónoma de Nayarit. Ciudad de la Cultura “Amado Nervo”,  Col. Centro,  C.P.: 63000, Tepic, Nayarit, México. Teléfono: (01) 311 211 8800, ext. 8922. E-mail: revistabiociencias@gmail.com, revistabiociencias@yahoo.com.mx, http://revistabiociencias.uan.mx. Editor responsable: Dr. Manuel Iván Girón Pérez. No. de Reserva de derechos al uso exclusivo 04-2010-101509412600-203, ISSN 2007-3380, ambos otorgados por el Instituto Nacional de Derechos de Autor. Responsable de la última actualización de este número Lic. Brenda Isela Romero Mosqueda y Lic. Elvira Orlanda Yañez Armenta. Secretaria de Investigación y Posgrado, edificio Centro Multidisciplinario de Investigación Científica (CEMIC) 03 de la Universidad Autónoma de Nayarit. La opinión expresada en los artículos firmados es responsabilidad del autor. Se autoriza la reproducción total o parcial de los contenidos e imágenes, siempre y cuando se cite la fuente y no sea con fines de lucro.

Licencia Creative Commons
Revista Bio Ciencias por Universidad Autónoma de Nayarit se encuentra bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional

Fecha de última actualización 02 de Octubre de 2019

 

licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional